原位雜交的基本原理是利用標(biāo)記的核酸探針與細(xì)胞或組織中的DNA或RNA進(jìn)行雜交,然后通過檢測(cè)標(biāo)記來識(shí)別探針的位置。這使得研究人員能夠在細(xì)胞或組織中確定特定基因或基因組區(qū)域的位置和表達(dá)水平。
原位雜交可以用于多種類型的實(shí)驗(yàn)。例如,它可以用來檢測(cè)特定基因在發(fā)育過程中的表達(dá)模式,或者確定特定基因變異在細(xì)胞中的分布。此外,原位雜交還可以用于診斷疾病,例如某些類型的,以及監(jiān)測(cè)效果。
菌落的裂解及DNA結(jié)合于纖維素濾膜
(1) 在一張保鮮膜上制作一個(gè)裝有0.5mol/L NaOH的小洼(0.75ml),使菌落面朝上,染色體原位雜交,將濾膜放到小洼上,展平保鮮膜,原位雜交,使濾膜均勻濕潤(rùn),讓濾膜留于原處2-3分鐘。
(2) 用干紙巾從濾膜的下方吸干濾膜,用一張新的保鮮膜和新配制的0.5mol/L NaOH重復(fù)步驟(1)。
(3) 吸干濾膜,將濾膜轉(zhuǎn)移到新的帶有1mol/L Tris·Cl(pH7.4)的保鮮膜洼上。5分鐘后吸干濾膜,再重復(fù)一次該步驟。
(4) 吸干濾膜,把它轉(zhuǎn)移到有1.5mol/L NaCl、0.5mol/L Tris·Cl (pH7.4)的保鮮膜小洼上5分鐘后吸干濾膜,轉(zhuǎn)移到一張干的濾紙上,置于室溫20-30分鐘,使濾膜干燥。
(5) 將濾膜夾在兩張干的濾紙之間,在真空烤箱中于80℃干烤2小時(shí),固定DNA。
(6) 將固定在膜上的DNA與32 P標(biāo)記的RNA進(jìn)行雜交。
熒光原位雜交(FISH)技術(shù)具有以下優(yōu)點(diǎn):
高特異性:熒光探針的合成是定向的,染色體熒光原位雜交,保證了雜交過程的特異性,可以有效地降低非特異性雜交和背景干擾。
高靈敏度:熒光信號(hào)的檢測(cè)比性信號(hào)的檢測(cè)更靈敏,植物原位雜交,可以檢測(cè)出低拷貝數(shù)的DNA序列,甚至可以檢測(cè)單個(gè)基因序列。
快速簡(jiǎn)便:FISH技術(shù)操作簡(jiǎn)便,雜交過程可以在數(shù)小時(shí)或數(shù)天內(nèi)完成,而且不需要過于復(fù)雜的設(shè)備,便于在實(shí)驗(yàn)室開展。
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